Mykobakterier standardundersøgelse (mikroskopi, én PCR, dyrkning, evt. identifikation, evt. resistensbestemmelse) (R-nr. 144)

Primær diagnostik: Ved formodning om sygdom forårsaget af mykobakterier, dels Mycobacterium tuberculosis kompleks (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, m.fl.), dels såkaldte "atypiske" / "non-tuberkuløse" mykobakterier.

Standardundersøgelsen indeholder mikroskopi og dyrkning for mykobakterier. Herudover udføres, som led i standardundersøgelsen, én PCR for M. tuberculosis kompleks for nye patienter, dvs. patienter hvor der ikke foreligger andre mykobakterieundersøgelser indenfor det seneste år. Denne PCR for M. tuberculosis kompleks indeholder genotypisk resistensbestemmelse for isoniazid og rifampicin. Hvis en prøve bliver mikroskopi positiv og PCR negativ for M. tuberculosis kompleks, laves PCR for atypiske mykobakterier. Udføres der supplerende regional mikroskopi og/eller PCR for M. tuberculosis kompleks, skal materiale fra samme prøve sendes til SSI (prøven deles) med henblik på standardundersøgelse. Er der ikke materiale nok til at dele prøven, skal hele materialet, sendes til SSI. Formalinfikseret, paraffinindstøbt væv kan ikke dyrkes, se nedenfor.

I Danmark anbefales ideelt dyrkning af 3 ekspektorater/2 ventrikelskyllevæsker eller en bronkialskyllevæske til initial diagnostik, inklusive mikroskopi, for at "udelukke" smitsom lunge TB.

Kontrol af behandlingseffekt:
For lunge TB monitoreres behandlingsrespons ved undersøgelse af ekspektorater. For at være ”helbredt” i.h.t. WHO-kriterier skal patienten have gennemført standardbehandling (jævnfør det nationale tuberkulose-program) OG have to negative TB-ekspektorat-dyrkninger med >= 7 dages mellemrum uden tegn til behandlingssvigt. ”Gennemført behandling” defineres som at patienten skal have gennemført standardbehandling (jævnfør det nationale tuberkulose-program) uden at opfylde kriteriet for “Helbredt” eller “Behandlingssvigt”. Behandlingssucces er summen af “Helbredt” og “Gennemført behandling”. 

Vedr. dyreprøver, se punktet "Prøvemateriale", tidspunkt og evt. prøvetagning” nedenfor.

ANBEFALET PRØVEMATERIALE - GENERELT
Send så meget prøvemateriale som praktisk muligt i hver beholder. Tag gerne flere prøver. Send ikke prøver som skal deles på SSI. Podepinde anbefales ikke, da de indeholder for lidt prøvemateriale. Prøvematerialet må ikke lægges i formalin eller sprit, da det dræber bakterier og ødelægger analysen.

BLOD OG KNOGLEMARV
Prøvemængde: Blod: 10 mL. Knoglemarv: Så meget som muligt.
Prøvebeholder: Hepariniseret blodprøveglas. Transporttiden skal være så kort som mulig. Opbevares ved stuetemperatur eller 35-37 °C indtil afsendelse.
Bemærkninger: EDTA som antikoagulant bør ikke anvendes, da det selv i små mængder hæmmer væksten af mykobakterier. Undersøgelse af blod og knoglemarv er relevant ved mistanke om miliær TB eller dissemineret infektion med andre mykobakterier. Det ses som oftest hos patienter med nedsat immunforsvar eks. ved HIV /AIDS eller immundefekt.

EKSSUDAT FRA SERØS HULHED
Prøvemateriale: Pleura-, perikardie-, ascites- eller ledvæske.
Prøvemængde: Så meget som muligt (helst 10-15 mL). Muligheden for at påvise mykobakterier stiger med prøvemængden.
Prøvebeholder: Tørt, sterilt plastrør.

FÆCES
Prøvemængde: Max. 5 mL.
Prøvebeholder: Fæcesrør med skruelåg. Prøvematerialet må ikke lægges i formalin eller sprit.

KVINDELIGE GENITALIER
Prøvemateriale: Vaginal- og cervixsekret, cervix- og endometrieskrab.
Prøvemængde: Så meget som muligt.
Prøvebeholder: Tørt sterilt plastrør.
Bemærkning: Podepind anbefales ikke, da prøvemængden er for ringe. Pga. variation i udskillelsen af mykobakterier tilrådes at undersøgelse foretages 3 gange nær midten af cyklus.

LUFTVEJSSEKRET
Prøvemateriale: Ekspektorat, trakeobronkialt sekret, bronkialskyllevæske (BAL).
Prøvemængde: Mindst 5-10 mL.
Prøvetagning: Ekspektorat: Prøven tages helst tidligt om morgenen, spyt og næsesvælgsekret undgås. Ekspektoratet skal opbringes ved "virkelig hoste", så patienten fornemmer, at det kommer nede fra lungerne. For bedre mobilisering af sekret instrueres patienten i at trække vejret 2 gange, hvor vejret holdes få sekunder inden udånding. Efter 3. indånding foretages en kraftfuld udånding og efter 4. indånding hostes kraftigt. Ekspektorat hostes op i steril beholder, og prøvematerialet overføres til SSI i ekspektoratdåse, der anbringes i den gule yderemballage. Prøvetagningen bør udføres udendørs eller i et velventileret rum, da den helt overvejende smittemåde er dråbeinfektion.

Trakeobronkialt sekret: Velegnet materiale kan ophentes ved sug gennem kateter eller bronkoskop.

Bronkialskyllevæske (BAL) ophentet ved bronkoskopi: Ved skylning af bronkoskopet før brug skal ubehandlet ledningsvand undgås, da dette kan indeholde mykobakterier, der vanskeliggør påvisning, isolation og resistensbestemmelse af M. tuberculosis complex. Anvend derfor sterilt vand.
Prøvebeholder: Tørt sterilt plastrør eller ekspektoratdåse. Prøvematerialet må ikke lægges i formalin eller sprit

Bemærkninger: Pga. variation i udskillelsen af mykobakterier anbefales internationalt, at der undersøges ekspektorater fra 3 på hinanden følgende dage. Hvis patienten ikke ekspektorerer, kan 2-3 gange ventrikelskyllevand eller 1 x BAL anvendes.

FORMALINFIKSERET, PARAFFININDSTØBT VÆV
Prøvemateriale og prøvemængde: Til analysen skal der indsendes 5 snit á 5 μm formalinfikseret, paraffinindstøbt væv. NB: Laboratoriet har ikke udstyr til at skære 5 μm snit, hvorfor fremsendte klodser returneres. Prøvebeholder: De 5 snit bedes fremsendt i rør og ikke som mikroskopi præparat.
Bemærkning: Hurtig påvisning af M. tuberculosis kompleks i histologiske prøver, hvor der er set granulomatøs inflammation men ikke sendt prøvemateriale til dyrkning, og hvor der ikke længere er prøvemateriale tilgængeligt for dyrkning (eller kun svært tilgængeligt). Svartid op til 2-3 hverdage efter prøvens modtagelse.

PUS OG SÅRSEKRET
Prøvemængde: Så meget som muligt aspireres med sprøjte (hvis der kun er en mindre mængde materiale, der ikke kan aspireres, lægges materialet på eSwab med tilhørende plastrør, evt. steril vatpind med et par dråber sterilt vand/saltvand i sterilt rør.
Prøvebeholder: Aspireret materiale: Tørt, sterilt plastrør.
Prøvematerialet må ikke lægges i formalin eller sprit

SPINALVÆSKE OG HJERNEVENTRIKELVÆSKE
Prøvemængde: Så meget som muligt (helst > 2 mL). Muligheden for at påvise mykobakterier stiger med prøvemængden.
Prøvebeholder: Tørt sterilt plastrør.
Ved meget ringe prøvevolumen kontaktes indsendende afdeling normalt med henblik på prioritering af analyser.

URIN
Prøvemateriale: Midtstråleurin fra morgenens første vandladning (mykobakterier akkumuleres i blæren i løbet af natten).
Prøvemængde: Minimum 40 mL fra hver af 3 på hinanden følgende dage.
Prøvebeholder: Tørt sterilt plastrør.

VENTRIKELSKYLLEVAND
Prøvetagning: Opsaml prøver tidligt om morgenen i 3 på hinanden følgende dage efter faste. En steril slange føres gennem munden ned i ventriklen. 200-300 mL sterilt vand (mindre hos børn) hældes gennem slangen ved hjælp af tragt. Det er vigtigt, at der stadig er vand i slangen. Ventriklen skylles et par gange ved hævertvirkning eller med stor sprøjte, hvorefter skyllevandet opsamles.
Prøvemængde: Op til 200 mL, mindre fra børn (ned til 10 mL).
Prøvebeholder: SSI flaske mærket "TB, ventrikel" emballeret i tilhørende æske.
Forsendelse: Hurtig forsendelse anbefales. Alternativt neutraliseres prøven med 200 mg (½ knivspids) NaHCO3 ("tvekulsurt natron") pr. 100 mL prøve før forsendelse. 

VÆV
Prøvemateriale: Hud, bindevæv, knoglevæv, glandelvæv, pleurabiopsi, obduktionsmateriale mm. Prøvebeholder: Vævsdåse eller tørt sterilt plastrør. Undgå tilsætning af formalin til prøvematerialet.

DYREPRØVER / ISOLATER
Prøvetagning, mængde, beholder og forsendelse tillempes ovenstående anbefalinger. Bemærk; hvis der fremsendes isolater fra dyr (eller undtagelsesvist non-tuberkuløse mykobakterier mennesker), så udføres der ”standardundersøgelse” (R-nr. 144), og ved påvisning af mykobakterier udføres speciesbestemmelse. (Se også DK-VET.dk).

Undersøgelsen kan rekvireres i WebReq under laboratoriet Statens Serum Institut eller på blanket nr. 1 "Bakterier" (lys orange kant).

Prøvemateriale og anden sygdom anføres af hensyn til valg af optimal forbehandlingsmetode og dyrkningssubstrater.

Prøven indesluttes i en robust beskyttelsesbeholder under forsendelsen.

Kan prøven ikke sendes samme dag skal den opbevares på køl (2-8 °C) og sendes hurtigst muligt.

Undtagelse: Blod og knoglemarv bør opbevares ved stuetemperatur eller 35-37 °C indtil afsendelse. Prøven beskyttes mod lys. Hvis prøven forventes at være undervejs i mere end 4 dage, bør den fremsendes på køl.

Mikroskopi:
Ingen, få, en del, eller mange syrefaste stave.

PCR for M. tuberculosis kompleks inklusive genotypisk resistensbestemmelse, se R-nr. 145.

Vedr. resistensbestemmelse:
Resistensbestemmelse for M. tuberculosis baseres på PCR og/eller DNA-sekvens. Denne PCR udføres direkte på patient prøver, og på isolat, hvis der ikke kan opnås resultat direkte på patientprøven. PCR’en kan påvise udvalgte resistensmutationer for isoniazid og rifampicin. Sekvens baseret resistensbestemmelse udføres på første isolat ved nye tilfælde og besvares med S eller R (følsom eller resistent) for førstevalgs stoffer.

Dyrkningsbaseret resistensbestemmelse for mykobakterier besvares S, I eller R (følsom, intermediær eller resistent) på udvalgte isolater.

Vedr. genotypning:
Resultat for sekvensbaseret epidemiologisk genotypning sendes til rekvirerende afdeling, men kan oplyses til behandlende læge og/eller smitteopsporingscenter på anmodning,  R-nr. 128.

Hasteprøver:
For hurtigst muligt svar på hasteprøver skal Afdeling for Tuberkulose og Mykobakterier adviseres om prøven direkte på tlf. 3268 3731 eller 5170 3054 på alle hverdage til kl. 20.00 og lørdage kl. 9.00-14.00, læs nærmere her.

Mikroskopi:
Resultatet besvares normalt samme dag prøven modtages, senest næste hverdag/lørdag. Alle positive nyfund forsøges udtelefoneret.

PCR for M. tuberculosis kompleks inklusive genotypisk resistensbestemmelse:
Se R-nr. 145.

Dyrkning/identifikation:
Resultatet afsendes, så snart det foreligger. Ved positiv dyrkning som oftest efter ca. 3 uger og ved negativ dyrkning ca. 8 uger efter prøvens modtagelse.

Resistensbestemmelse, både dyrkningsbaseret og sekvensbaseret:
Resultatet besvares skriftligt, typisk inden for 14 dage efter isolation af tilstrækkelig og ren vækst af mykobakterier. Alle nyfund af multiresistent (rifampicin og isoniazid resistent) tuberkulose udtelefoneres, se genotypisk PCR for resistensbestemmelse ovenfor.

Epidemiologisk typning med helgenom sekventering:
Resultatet foreligger rutinemæssigt typisk inden for 14 dage efter isolation af mykobakterier tilhørende M. tuberculosis kompleks, se R-nr. 128.

Mikroskopi: Sensitiviteten er ca. 60% sammenlignet med dyrkning af mykobakterier. Negativ mikroskopi udelukker derfor ikke forekomst af mykobakterier. Specificiteten er > 99% for Mycobacterium genus. Positivt resultat viser tilstedeværelse af levende eller døde mykobakterier i prøven, men ikke arten. Ved fund af syrefaste stave i luftvejsprøver fra en ubehandlet tuberkulosepatient, anses patienten for smittefarlig. Efter behandlingsstart kan der i op til flere måneder forekomme døde mykobakterier i kontrolprøver. Undersøgelsen har derfor, i modsætning til dyrkning, begrænset værdi til kontrol af behandlingseffekt.

PCR for M. tuberculosis kompleks inklusive genotypisk resistensbestemmelse: Se R-nr. 145.

Dyrkning: Sensitiviteten er høj, men negativt resultat udelukker ikke infektion med mykobakterier. Sensitiviteten øges med antallet af undersøgte prøver. Derfor anbefales i Danmark 3 prøver. Ved positivt resultat afspejler antallet af kolonier prøvens indhold af levende mykobakterier. Undersøgelsen er derfor, i modsætning til PCR, egnet til kontrol af behandlingseffekt.

Artsbestemmelsen: Er vejledende for behandlingen.
Fund af arter tilhørende M. tuberculosis kompleks er normalt patologisk og bør medføre behandling. Fund af andre arter kan være patologisk, afhængig af art, bakterieantal, lokalisation og øvrige kliniske og parakliniske fund.  

Dyrkningsbaseret resistensbestemmelse: Graden af resistens angives som følsom eller resistent vurderet ud fra kritiske koncentrationer af det pågældende stof.

Epidemiologisk typning: Anvendes til at følge tuberkulosesituationen i Danmark samt til smitteopsporing ved samfundserhvervet, erhvervsbetinget eller nosokomiel tuberkulose. DNA genotypen for det aktuelle isolat sammenlignes med genotyper fra andre patienter. Identiske genotyper i flere patienters isolater indikerer, at patienterne kan tilhøre samme smittekæde.

Mycobacterium tuberculosis kompleks indeholder M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii, M. caprae, M. orygis, M. mungi og M. pinnipedii.

Referencer

• Tuberkulosebekæmpelse i Danmark: Et nationalt tuberkuloseprogram 2018
• World Health Organization. Policy guidance on drug susceptibility testing (DST) of second-line anti-tuberculosis drugs (pdf)
• Companion handbook to the WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis (pdf)
• Diagnostik og behandling af tuberkulose (2023) (pdf). Via Dansk Selskab for Infektionsmedicins hjemmeside
• Tuberkulosebekæmpelse i Danmark (2010) (pdf). Via Dansk Selskab for Infektionsmedicins hjemmeside.
• Cambau E, Rüsch-Gerdes S. First and second line susceptibility testing for mycobacterium tuberculosis complex Handbook on TB laboratory diagnostic methods for the European Union European Center for disease prevention and control (ECDC) ed, ECDC, Stockholm (2016) (pdf)
• Domínguez J, Boettger EC, Cirillo D, Cobelens F, Eisenach KD, Gagneux S, Hillemann D, Horsburgh R, Molina-Moya B8, Niemann S, Tortoli E, Whitelaw A, Lange C; TBNET; RESIST-TB networks. Clinical implications of molecular drug resistance testing for Mycobacterium tuberculosis: a TBNET/RESIST-TB consensus statement. Int J Tuberc Lung Dis 2016;20(1):24-42.
• American Thoracic Society Documents. An official ATS/IDSA stratement: Diagnosis, treatmentm and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med 175:367-416, 2007. 
• FA Drobniewski, S Hoffner, S Rusch-Gerdes, G Skenders, V Thomsen and the WHO European Laboratory Strengthening Task Force. Recommended standards for modern tuberculosis laboratory services in Europe. Eur Respir J 2006; 28: 903-9.

• Mycobacterium tuberculosis kompleks DNA (PCR) ekstraundersøgelse & standardundersøgelse (R-nr. 145)
• Mycobacterium tuberculosis kompleks, haster PCR-undersøgelse & standardundersøgelse (R-nr. 146)
• Azithromycin (koncentrationsbestemmelse) (R-nr. 1016)
• Isoniazid (koncentrationsbestemmelse) (R-nr. 1012)
• Mykobakterier miljøundersøgelse (dyrkning, evt. mikroskopi, evt. PCR, evt. identifikation, evt. resistensbestemmelse, evt. genotypning) (R-nr. 177)
• Interferon gamma-frigørelse (TB-relateret) (Mycobacterium tuberculosis) (R-nr. 178)

Undersøgelsen indeholder flere analyser. Før disse bliver udført, bliver de fleste prøver forbehandlet med NaOH for at homogenisere og opkoncentrere prøven og for at dekontaminere og herved mindske risikoen for overvækst af uvedkommende bakterier og svampe. Mikroskopi af syre-alkohol-farvet præparat, PCR og dyrkning laves efterfølgende. Ved positiv PCR og/eller vækst bliver isolatet artsbestemt med forskellige molekylærbiologiske og genotypiske metoder. På M. tuberculosis kompleks udføres i Danmark resistensbestemmelse og epidemiologisk genotypning, mens øvrige mykobakterier bliver undersøgt på forskellige vis, se nedenfor.

Fluorescensmikroskopi: Udføres efter farvning med auramin/rhodamin og affarvning med syre og alkohol.

PCR for M. tuberculosis kompleks inklusive genotypisk resistensbestemmelse: Se R-nr. 145.

Dyrkning:
Udføres på specialsubstrater afhængigt af prøvematerialet. Alle prøver dyrkes i et automatiseret dyrkningssystem, som aflæses en gang i timen. Formalinfikseret, paraffinindstøbt væv kan ikke dyrkes.

Artsbestemmelse:
Udføres i flere trin. De hyppigst forekommende arter identificeres ved genamplifikation efterfulgt af hybridisering til artsspecifikke prober. Yderligere fysiologiske tests eller sekventering kan være påkrævet. Artsbestemmelse udføres normalt på isolatet fra patientens første dyrkningspositive prøve, og på efterfølgende isolater, der formodes at tilhøre en anden art. Udføres desuden ved positivt dyrkningsfund > 1/2 år efter seneste artsbestemmelse samt lejlighedsvist på mikroskopi positive primære prøver.

Resistensbestemmelse:
M. tuberculosis kompleks resistensbestemmelse udføres normalt v.h.a. PCR på den primære prøve overfor isoniazid og rifampicin, hvis der er DNA nok. Det udføres desuden på det første isolat og efterfølgende hver 3. måned, så længe patientens prøver er dyrkningspositive. Yderligere resistensbestemmelser kan rekvireres. Resistensforhold bestemmes primært over for følgende stoffer: ethambutol, rifampicin, isoniazid og pyrazinamid. Ved resistens udføres supplerende resistensundersøgelser for 2nd line stoffer. 

Resistensbestemmelse hurtigvoksende mykobakterier (fx M. abscessus, M. fortuitum, M. mucogenicum, og M. peregrinum) udføres normalt på det første isolat og en gang årligt derefter. Yderligere resistensbestemmelser kan rekvireres. Undersøgelsen udføres ved MIC-bestemmelse for bla. clarithromycin, amikacin, moxifloxacin, doxycyclin, sulfatrim, linezolid og tigecyclin.

Resistensbestemmelse langsomtvoksende mykobakterier (fx Mycobacterium avium kompleks (MAC; M. avium, M. intracellulare, M. chimaera mv.) udføres ikke rutinemæssigt, da der generelt er usikker korrelation mellem resistensbestemmelse og behandlingseffekt (dog undtaget makrolider). Ved tidligere makrolidbehandling eller recidiv under behandling med makrolider kan resistensbestemmelse rekvireres.
 
Resistensbestemmelse foretages i første omgang over for clarithromycin og amikacin. I tillæg kan også resitensbestemmes over for bl.a. rifampicin, rifabutin, ethambutol, linezolid og moxifloxacin bestilles. 

Epidemiologisk typning:
Foretages ved helgenomsekvensering. Analysen udføres normalt på det første M. tuberculosis kompleks isolat samt ved recidiv - normalt uden beregning i Danmark.

IVDR risikoklasse: C
In house komponent: DNA-oprensning, Library preparation, Pipeline 
Internt reference nummer: R-nr. 144
Komponenten opfylder generelle krav til sikkerhed og ydeevne.

Mykobakterier, standardundersøgelse

   Undersøgelsen er akkrediteret af DANAK efter ISO 17025.

Mikroskopi, dyrkning og artsbestemmelse af de hyppigste mykobakteriearter samt resistensbestemmelse af M. tuberculosis kompleks for 1. valgs stoffer er ISO17025 akkrediteret af DANAK under registreringsnummer 397 til prøvning.

SSI00144
SSI00235
503851017100000 Mycobacterium Udredning - Blod (heparin-glas)
503851006000000 Mycobacterium Udredning - Knoglemarv
503851040000000 Mycobacterium Udredning - Pleuravæske
503851041000000 Mycobacterium Udredning - Perikardievæske
503851042000000 Mycobacterium Udredning - Ascitesvæske
503851030000000 Mycobacterium Udredning - Ledvæske
503853043300000 Mycobacterium Udredning - Fæces
503855046030700 Mycobacterium Udredning - Sekret - podning - Vagina
503855046030760 Mycobacterium Udredning - Sekret - podning - Cervix
503855000030760 Mycobacterium Udredning - Podning - Cervix
503855000030745 Mycobacterium Udredning - Podning - Endometrium
503852014000000 Mycobacterium Udredning - Ekspektorat
503852016000000 Mycobacterium Udredning - Trakealsekret
503856015000000 Mycobacterium Udredning - Bronkoalveolær lavage {BAL}
503852020000000 Mycobacterium Udredning - Pus
503855030000000 Mycobacterium Udredning - Sår - podning
503851020000000 Mycobacterium Udredning - Spinalvæske
503851020200000 Mycobacterium Udredning - Hjerneventrikelvæske {liquor}
503853011000000 Mycobacterium Udredning - Urin - midtstråle
503856012000000 Mycobacterium Udredning - Ventrikelskyllevæske {mavesæk}
503854000900000 Mycobacterium Udredning - Biopsi-hud
503854003000000 Mycobacterium Udredning - Knoglevæv
503854006000000 Mycobacterium Udredning - Lymfeknude - væv
503854001020020 Mycobacterium Udredning - Biopsi - Pleura
503854000000000 Mycobacterium Udredning - Væv
503855000030700 Mycobacterium Udredning - Podning - Vagina
503856010099999 Mycobacterium Udredning - Skyllevæske - Anatomisk lokalisation angivet i fritekst
503852016100000 Mycobacterium Udredning - Trachealsekret fra tube
503856000110202 Mycobacterium Udredning - Aspirat (opsug) – Larynx
503852021010250 Mycobacterium Udredning - Sekret – bihule
503852021020022 Mycobacterium Udredning - Sekret – bronkier
503852021020030 Mycobacterium Udredning - Sekret – lunge
503852021010210 Mycobacterium Udredning - Sekret – tracheostoma 

SSI00144

Tuberkulose & Mykobakterier

T. 3268 3731 & 5170 3054
@. tuberkulose@ssi.dk

Telefontid:
Mandag-fredag kl. 8.00-20.00
Lørdag kl. 9.00-14.00